（1）人间充质干细胞复苏（以T-75瓶为例）

①从冰箱中取出完全培养基，在生物安全柜或超净台中吸取适量（如T-75瓶：10-15mL)完全培养基沿上表面加入间充质干细胞培养瓶中，切勿冲到细胞培养瓶底面，即：细胞生长面。然后慢慢将细胞培养瓶平放，在37℃、恒温CO2培养箱中放置5-10分钟后使用。

温馨提示：请严格按照此步骤操作，否则可能会出现细胞培养瓶中细胞生长空白区域，即所谓的“生长空洞”。多数用户使用的不是专用的预包被细胞培养瓶，而是普通的细胞培养瓶或培养皿，其表面环境并不利于无血清培养环境下的间充质干细胞贴壁。37℃放置5-10分钟，可让培养基中的促贴壁物质更好地与细胞培养瓶底部结合，使得间充质干细胞的贴壁能力增强，降低“生长空洞”出现的概率。

②从液氮中取出冻存的间充质干细胞，迅速将冻存管放入37℃水浴中，快速融解。

温馨提示：尽可能避免水没过管帽，以减少污染的风险；要快速完成细胞复苏过程（尽量控制在1分钟内），融化过程时间过长，会造成复苏后细胞活性较差。

③用70%-75%酒精消毒冻存管外壁，在生物安全柜或超净台中打开冻存管，用吸管/移液器将细胞冻存悬液缓慢移入装有5-10mL细胞完全培养基的15mL离心管中（在这一过程请尽可能避免产生气泡）。

温馨提示：为了减少细胞损失，往细胞冻存管中加入1mL完全培养基，稍微吹打，用吸管/移液器将这1mL的细胞悬液吸入离心管中，再用吸管/移液器将离心管中的细胞轻轻吹打混匀。

④1200rpm离心5min，弃上清，加入2mL完全培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数，按密度2×104cells/cm2将细胞接种至步骤①中孵育完的细胞培养瓶中，添加细胞时，将细胞培养瓶竖立，细胞悬液直接加到底部，切忌冲到细胞培养瓶底面。

⑤轻轻摇晃细胞培养器皿，使细胞均匀分布，混匀后，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养。

⑥24h后，更换新鲜的完全培养基（温育至37℃）。

（2）人间充质干细胞传代（以T-75瓶为例）

①在显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到80-90%，即可传代。

温馨提示：细胞融合度请勿超过90%。很多传代后的细胞大比例死亡，是由于传代前细胞生长过密（融合度过高），导致细胞消化异常（细胞整片或成片脱落），加之随后的不当操作（如用移液器反复吹打成片细胞使其成为单个细胞），此机械损失过程会严重损害细胞膜，引发大比例的细胞死亡；间充质干细胞经冻存后再次使用时，尤为明显。

②预处理细胞培养瓶，处理方法同细胞复苏中的步骤①。

③在生物安全柜或超净台中，弃去细胞培养瓶中的培养液，加入5-10mL PBS清洗细胞后弃去，再加入2mL 0.05%胰酶-EDTA消化细胞。

④在显微镜下观察到细胞变圆时，立即加入5mL胰酶抑制剂终止消化。

⑤用移液器轻轻吹打瓶壁上还未完全脱离的细胞，并轻轻吹打混匀，使细胞完全分散。

⑥将细胞悬液转移至15mL离心管中，1200rpm离心5min。弃上清，加入2mL细胞完全培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数，按细胞密度2×104cells/cm2，将细胞接种至细胞传代②步骤中孵育完的细胞培养瓶中，添加细胞时，将细胞培养瓶竖立，细胞悬液直接加到底部，切忌冲到细胞培养瓶底面。

⑦轻轻摇晃细胞培养器皿，使细胞均匀分布，混匀后，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中静置培养。

（3）人间充质干细胞冻存

①用0.05%胰酶-EDTA消化待冻存的细胞，加入胰酶抑制剂终止消化并离心，重悬后进行细胞计数。

②1200rpm离心5min，弃上清。

③根据细胞计数情况，缓慢加入适量冷的无血清冻存液（无血清冻存液可即拿即用或置于冰袋备用），调整细胞密度在1×106cells/mL左右。

④轻轻地重悬细胞，将重悬均匀的细胞按等份加入到灭菌的冻存管中（需提前做好标记），旋紧冻存管盖。

⑤迅速将冻存管放入程序降温盒中，然后将冻存盒直接放入-80℃冰箱。

⑥过夜放置后，将细胞从-80℃冰箱转移至液氮罐中长期保存。